Производство антибиотиков. Способы получения

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

ТЕХНОЛОГІЯ БІОСИНТЕЗУ БЕНЗИЛПЕНІЦИЛІНУ

4.1 Характеристика об’єкту біосинтезу: 

до пеніцилінів відноситься група близьких по хімічних властивостях сполук, що містять у своїй структурі β-лактамне й тіазолідинове кільця: (мал. 2) [2].

мал. 2. Структурна формула пеніциліну.

В пеніцилінах R-радікал може бути представлений різними структурами. Найбільш відомий і широко використовуваним є бензилпеніцилін, або пеніцилін G, в якому радикал представляє собою бензильний залишок (C₆H₆– CH₂– ), в пеніциліні V радикалом є феноксиметил (C₆H₆– О – CH₂– ) [3].

В 30-х роках пеніцилін отримували методом поверхневого культивування. Технологія була досить примітивною – продуцент культивували в колбах або пляшках. Потреба в пеніциліні була дуже велика і об’єм його виробництва, хоч і в примітивних умовах, швидко збільшувався. Для культивування продуцента використовувались навіть пляшки з-під молока, оскільки були в наявності машини для їх миття та обробки. В кожну пляшку наливали поживне середовище шаром 1 – 4 см, що забезпечувало необхідні умови аерації. Пляшки поміщали в спеціальні кошики, стерилізували, а потім охолоджували. Сухі спори або їх водну суспензію вносили в пляшки пульверизаторами або піпетками і ферментували протягом 5 – 10 діб за температури 24 °С.

На сьогоднішній день у всьому світі пеніцилін отримують так, як і решту антибіотиків, методом глибинного культивування [4].

Більшість пеніцилінів виготовляють у вигляді натрієвих або калієвих солей. Новокаїнові і бензатинові солі є основою пролонгованих препаратів пеніциліну для внутрішньо-м’язового введення. В сухій кристалічній формі пеніцилінові солі досить стабільні протягом тривалого терміну за температури 4 °С. На сьогоднішній день бензилпеніцилін необхідний не тільки як медичний препарат, але і як речовина, що є вихідним продуктом для отримання 6-АПК і в подальшому напівсинтетичних пеніцилінів. Із загальної кількості природних пеніцилінів приблизно 35 % використовуються як медичні препарати, а 65 % – для отримання 6-АПК [1].

4.2 Характеристика продуцента

В якості продуцента широко використовують культури Penicillium chrisogenum, види Penicillium утворюють спори (конідії).

До роду Penicillium входять гіфальні мікроорганізми із септованим міцелієм, що утворює конідіальні китиці на септованих конідієносцях. Конідії одноклітинні, круглі або овальні і переважно зеленого кольору. Рід Penicillium нараховує близько 900 описаних видів, систематика яких значною мірою базується на особливостях формування китиць (одномутовчасті, двохмутовчасті, неправильні). Рід поділяється на підроди: Eupenicillium, Gliocladium, Scopulariopsis, Paecilomyces, Citromyces. Penicillium chrysogenum належить до секції Asymmetrica, підсекції Asymmetrica-Velutina. Колонії на агаризованому середовищі плоскі, бархатисті. Розвинутий повітряний міцелій. З верхньої сторони колонії синьо-зелені, іноді з краплинами жовтого екссудату, з нижньої – безбарвні або жовтуваті. Конідії від еліптичних (3,3 × 4 мкм) до округлих (4 мкм), часто зібрані в тісні колонки. Конідієносці гладенькі [5].

В розвитку міцелію спостерігається ряд різних фаз. На початку і в середині розвитку міцелію у клітинах накопичуються жири. Згодом їх кількість зменшується, з’являються вакуолі з гранулами рибонуклеополіфосфатів, потім починається автоліз. Інтенсивний синтез пеніциліну починається за наявності великої кількості біомаси міцелію, за повного виснаження глюкози і молочної кислоти в середовищі і за рН, близького до нейтрального.

Для отримання пеніциліну спочатку розмножують спори. Їх можна вирощувати на агаризованих середовищах, в складі яких входить 0,5 % меляси, 0,5 % пептону, 0,4 % повареної солі, 0,01 % однозаміщеного фосфату калію і 0,005 % сульфату магнію. Спори вирощують за температури 25 – 27 °С протягом 4 – 5 діб. В промисловості спори часто отримують, вирощуючи міцелій в скляних флаконах на просяному середовищі. Висушений споровий матеріал можна зберігати навіть за кімнатної температури.

Отриманий споровий матеріал використовують для засіву інокуляторів (1 – 3 флакони на апарат, де міцелій розмножують до кількості 5 – 10 % від об’єму посівних ферментерів) [4]. Промислові штами під час селекції дають невелику кількість варіантів, із яких відбирають найбільш активні і стабільні для подальшого використання. Культури зберігаються в ліофілізованому стані протягом 3 років. Пеніциліни також можуть синтезувати Penicillium notatum, P. brevicompactum, P. nigricans, P. turbatum, P. steckii, P. corylophylum, Aspergillus flavus, A. janus, A. nidulans [5].

4.3 Підготовка посівного матеріалу

Підготовка посівного матеріалу – одна з найвідповідальніших операцій у циклі біотехнологічного способу одержання антибіотиків. Від кількості і якості посівного матеріалу залежить як розвиток культури у ферментері, так і біосинтез антибіотика. Продуцент зазвичай вирощують на багатих по складу натуральних середовищах, здатних забезпечити найвищу фізіологічну активність мікроорганізмів. Підготовка посівного матеріалу – процес багатоступеневий (мал. 3).

Мал. 3. Схема багатоступеневого приготування посівного матеріалу А – вирощування у флаконах, Б – вирощування у колбах на качалках: 1 – законсервований вихідний матеріал; 2 – спорова генерація на скошеному агарі в пробірці; 3 – II спорова генерація на твердому середовищі; 3а і 3б – I і III генерації на рідкому середовищі в колбі; 4 – ферментер попереднього інокулювання; 5 – ферментер інокулювання; 6 – основний ферментер.

Мікроорганізм попередньо вирощують на агаризованому середовищі в пробірці (1, 2), потім із пробірки роблять висів у колби з рідким поживним середовищем, проводять дві генерації методом глибинного вирощування на качалках протягом двох-трьох діб для кожної генерації (3а й 3б). Із другої генерації культури в колбі роблять посів у невеликий (10 л) інокулятор 4, після чого добре розвинену культуру переносять у більший інокулятор 5 (100 – 500 л), звідки й роблять посів в основний ферментер 6. Для посіву в основний ферментер використовують від 5 до 10 % посівного матеріалу (інокуляту) [2].